| Abstract | Odredivanje pH vrijednosti i razine kisika sastavni je dio znanosti i industrije. Medu ostalim primjenama u razlicitim podrucjima, ovi su parametri od iznimne važnosti za proucavanje živih stanica zbog velikog utjecaja na njihov rast i metabolizam. Posljednjih se godina razvija opticko dualno senziranje, korištenjem senzorskih membrana koje omogucuju istovremeno pracenje dva parametra. To se ostvaruje korištenjem zasebnih sondi za svaki od analitickih parametara, kombinirajuci ih u odgovarajuce polimerske matrice na nacin da ne utjecu jedna na drugu. Takvi senzori nude brojne prednosti pred pojedinacnim senzorima. Zbog toga je razvijanje dualnih senzora za mjerenje pH vrijednosti i kisika vrlo znacajno za razumijevanje ponašanja stanica te razvijanja platformi za njihovo proucavanje. Cilj ovoga rada bio je dizajnirati sustav za istovremeno mjerenje pH vrijednosti i otopljenog kisika pomocu fluorescentnih optickih sondi.
Pojam fluorescencija odnosi se na emisiju svjetlosti iz tvari induciranu apsorpcijom svjetla. Fluorescentni senzori temeljeni su na cinjenici da efekt gašenja utjece na intenzitet i vremensku konstantu fluorescencije. Do gašenja fluorescencije dolazi kada fluorofor u pobudenom stanju dode u kontakt sa tvari koja uzrokuje njegov povratak u osnovno stanje bez da pritom emitira fotone. Tehnike za proucavanje fluorescentnih senzorskih materijala odnose se na pracenje promjena intenziteta te vremena fluorescencije. U slucaju tehnike dualnog referenciranja vremena fluorescencije, sonda kratkog vremena fluorescencije referencira se u odnosu na materijal dugog vremena fluorescencije, neovisan o promatranom parametru. Ova se metoda može koristiti za dizajniranje dualnih senzora za pH i kisik. Tada indikator dugog vremena fluorescencije (indikator za kisik) služi kao referenca za indikator kratkog vremena fluorescencije (pH indikator), rezultirajuci izlaznim signalom s faznim pomakom ovisnim o vrijednostima oba parametra. Ova se metoda naziva modificirano dualno referenciranje vremena fluorescencije. U ovom je radu modificirano dualno referenciranje vremena fluorescencije korišteno za mjerenje kisika i pH vrijednosti. Odziv dualnih senzora je ocitavan uredajem SensorDish Reader (SDR), komercijalnim 24-kanalnim citacem za neinvazivnu detekciju kisika i pH u mikrotitracijiskim posudama. Unutar posude nalaze se fluorescentni senzori. Pobuduje ih SDR koji se nalazi ispod posude te neinvazivnim putem detektira vrijeme fluorescencije kroz transparentno dno posude. Programska potpora za upravljanje SDR-om razvijena je korištenjem programskog paketa Visual Studio. Korištenjem RS-232 komunikacije, omoguceno je slanje naredbi uredaju te primanje podataka koji opisuju odziv senzora. Odziv dualnih optickih senzora prikupljen je za razlicite kombinacije pH vrijednosti i kisika. Nakon podešavanja pH i kisika, izvodi se serija ocitavanja uz mijenjanje modulacijske frekvencije citaca. Odzivi senzora se šalju na racunalo te se koriste za dobivanje informacije o razini pH i kisika. To je omoguceno promatranjem modela sustava u obliku nadomjesne sheme elektricnog kruga. Randlesov model elektricnog kruga
sadrži otpornik koji opisuje pH vrijednost te paralelni spoj otpornika i kapaciteta za
modeliranje fluorescencije sonde za kisik. Ovaj model, zajedno sa Stern-Volmer jednadžbama
koje opisuju gašenje fluorescencije, omogucava odredivanje pH vrijednosti i kisika iz odziva dualnih senzora. Razliciti senzorski materijali su testirani za dualno mjerenje kisika i pH vrijednosti. Ru(dpp) je korišten kao indikator za kisik dugog vremena fluorescencije, a HPTS je upotrijebljen kao pH sonda. Funkcije koje opisuju odziv senzora u ovisnosti o pH i kisiku su evaluirane i uspored¯ene za razlicite materijale. Pokazano je da Ru(dpp) služi kao pouzdana sonda za mjerenje kisika, no HPTS pokazuje odred¯ene nedostatke pri odredivanju pH vrijednosti. Istraživanje alternativnih sondi za pH, sa drugacijim kemijskim svojstvima, nužno je za unaprjedivanje dualnih senzora i ostvarivanje potpuno neovisnog mjerenja kisika i pH vrijednosti. Sustav za dualno opticko mjerenje kisika i pH je ostvaren u sklopu ovoga rada, pokazujuci kako se modificirano dualno referenciranje vremena fluorescencije može koristiti
za istovremeno ocitavanje odziva fluorescentnih dualnih senzora. Razvoj dualnih senzorskih
materijala za mjerenje kisika i pH vrijednosti je od velike važnosti za analizu aktivnosti stanica te može služiti kao znacajni alat u razlicitim podrucjima znanosti i biotehnologije. |
| Abstract (english) | pH and oxygen are often determined analytical parameters in research and industry.
Among other applications, oxygen and pH values are one of the most important analytes
in cellular cultivation, since they both have a strong effect on cell growth and
metabolism. Recently, there has been a lot of progress in the area of optical dual
sensing, using sensor membranes which are able to monitor two parameters simultaneously.
This is made possible by using separate probes for each analyte in appropriate
polymer matrices in a way that they do not interfere. Such sensors overcome some of
the limitations of single sensors. Therefore, combining complementary sensors for pH
and oxygen appears to be very valuable for understanding cellular behavior and further
development of cell analysis platforms. The purpose of this work was designing a
system for simultaneous, fluorescence-based sensing of pH and oxygen.
Fluorescence is a term used to describe the emission of light from a substance, induced
by light absorption. Sensing based on fluorescence makes use of the fact that
fluorescence intensity and lifetime change due to fluorescence quenching. It occurs
when a fluorophore in an excited state comes into contact with a quencher that returns
it to the ground state, without a photon being emitted. Luminescent sensor materials
can be interrogated using either intensity or lifetime- based techniques. In the dual
lifetime referencing (DLR) technique, the short lifetime analyte-sensitive luminophore
is referenced against a long-lifetime luminophore that is insensitive to the analyte. The
DLR technique can be used for designing dual sensors for oxygen and pH. In that case,
the long-lived luminescent (oxygen) indicator acts as a reference for the short-lived fluorescent
(pH) indicator, so that the observed phase shift depends on the concentration
of both analytes. This method is referred to as "modified dual lifetime referencing
method" (m-DLR).
In this work, modified dual lifetime referencing is applied for oxygen and pH sens-
79
ing. Sensor response is read out using SensorDish Reader (SDR), a commercially
available 24-channel reader for non-invasive detection of oxygen and pH in multiwell
plates. A sensor spot, containing luminescent dye, is fixed at the bottom of each
well. It is excited by the SDR placed below, and its luminescence lifetime is detected
non-invasively through the transparent bottom. Software for controlling the SDR was
developed in Visual Studio. Using RS-232 communication, it enables sending commands
to SDR and acquiring data describing sensor response.
Dual optical sensors responses were measured for different combinations of pH and
oxygen. After adjusting pH and oxygen levels, a series of sensor scans is performed,
while changing the modulation frequency of the reader. Sensor response values are
sent to PC, where they can be used for extracting information about pH and oxygen.
This is achieved by observing the equivalent circuit describing the dual sensing system.
The circuit model (known as the Randles circuit) consists of a resistance component
describing pH, as well as a resistance and capacitance modeling oxygen fluorescence.
This, together with Stern-Volmer equations for fluorescence quenching, allows determination
of pH and oxygen from the measurement data.
Different sensing materials were tested, applying Ru(dpp) as the long-lived oxygen
indicator and HPTS as the short-lived pH probe. Functions describing oxygen and pH
were evaluated and compared. Though Ru(dpp) acts as a reliable probe for oxygen
sensing, HPTS seems to have certain drawbacks. Exploring alternative pH probes with
different chemical properties is necessary for improving the performance of the dual
sensors and increasing independence of oxygen and pH determination.
A system for dual optical sensing of oxygen and pH was achieved as part of this work,
showing how modified dual lifetime referencing can be applied for simultaneous sensor
readout. Developing dual sensing materials for oxygen and pH is of great importance
for analyzing cellular activity and could serve as a powerful tool in many areas
of research and biotechnology. |
